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免疫荧光基本实验步骤说明
更新时间:2019-12-26 点击次数:953次
 
  
  免疫荧光技术又称荧光抗体技术,是标记免疫技术中发展早的一种。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合,利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。它是根据抗原抗体反应的原理,先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团,再用这种荧光抗体(或抗原)作为探针检查细胞或组织内的相应抗原(或抗体)。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织,从而确定抗原或抗体的性质和定位。
  
  一、免疫荧光技术基本实验步骤:
  
  1、细胞准备。对单层生长细胞,在传代培养时,将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中,待细胞接近长成单层后取出盖玻片,PBS洗两次;对悬浮生长细胞,取对数生长细胞,用PBS离心洗涤(1000rpm,5min)2次,用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。
  
  2、固定。根据需要选择适当的固定剂固定细胞。固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4℃保存3个月。
  
  3、通透。使用交联剂(如多聚甲醛)固定后的细胞,一般需要在加入抗体孵育前,对细胞进行通透处理,以保证抗体能够到达抗原部位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。
  
  4、封闭。使用封闭液对细胞进行封闭,时间一般为30min。
  
  5、一抗结合。室温孵育1h或者4℃过夜,PBST漂洗3次,每次冲洗5min。
  
  6、二抗结合。间接免疫荧光需要使用二抗,室温避光孵育1h.PBST漂洗3次,每次冲洗5min后,再用蒸馏水漂洗一次。
  
  7、封片及检测。滴加封片剂一滴,封片,荧光显微镜检查。
  
  二、免疫荧光技术注意事项:
  
  1、染完之后没有封片前直接照一些,因为有的时候可能封片会出现问题,再想照反而没有了,另外不要拖太长时间,荧光会崔灭的。
  
  2、荧光的片子一定要避光保存,保存的好的话,过一段时间仍然能照出很好的片子。
  
  3、二抗用之前一定离心,不然有的时候有那种沉淀,在片子上就是一个很大的非特异性荧光光点,非常难看。
  
  4、整个操作在4℃下进行,洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN3,上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。
  
  5、洗涤要充分,以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合,出现假阴性。
  
  6、加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体,降低和防止非特异性染色。
  
  7、细胞活性要好,否则易发生非特异性荧光染色。抗淬灭剂可拿来直接封片,20微升即可,之后片子可保留更长时间。